Page 419 - 《环境工程技术学报》2023年第1期

第 1 期 王京等：BDE-20 对斑马鱼肠道的慢性毒性效应 · 415 ·
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新暴露介质以保持适当的化学浓度，其他条件均与 （Thermo Scientific，美国）上的读数进行检测。用
驯养期保持一致。暴 露 28 后，对所有鱼类实施安 RQ1 RNase-Free DNase（Promega，美国）从 RN 提
d
A
乐死，解剖并收集肠道组织。每组随机取 出 1 条鱼 取物中去除污染 物 DN 后，使用商业化反转录试剂
A
的肠道，将 这 4 条完整的成年斑马鱼肠道浸泡在 盒（上海翌圣生物科技有限公司）合 成 cDNA。采用
n
4 % 多聚甲醛中固定，用于后续组织病理学分析。随 SYBR Gree 试剂盒（上海翌圣生物科技有限公司）
后每个水箱随机 取 1 条肠道，混 合 5 条肠道作为 在 ABI 7 300 plus real-time PC 检测平台（Thermo
0
R
1 份样本，每组共采 集 6 份样本，立即将其冷冻在液 Scientific，美国）上进行实时荧光定 量 PC 分析。利
R
氮中并保存在−80 ℃ 下，用于后续分子生物学分析。 用 Primer 软件设计了肠道屏障功能、炎症、凋亡关
3
1.3 肠道组织病理学分析 键相关基因的引物序列，相关序列如 表 1 所示。利
将收集到的完整肠道置 于 4 ℃ 4 % 多聚甲醛中 用 2 −ΔΔC T 方法将目标基因的转录水平与核糖体蛋白
固 定 24 h，随后依次 用 70%、80%、90 % 和 100 % 的
表 1 实时荧光定 量 PC 分析中使用的
R
乙醇对肠道组织进行脱水，经组织透明、浸蜡、包埋 目标基因引物的序列
等常规操作后，将包埋块固定在标本夹持器上，取肠 Table 1 The sequences of target genes primer pairs used in the
道的中肠部位切成 厚 4～5 µ m 的切片。切片经脱 RT-qPCR analysis
蜡，苏木精-伊红（H & E）染色后，进行脱水封片，在 基因名称 引物序列(5’-3’) 序列注册号
显微镜（Nikon Eclipse E100，日本）下观察组织形态 前置引物：
AACAGAGCCGTTGTTGGTGTT
结构变化。 Rpl8 后置引物： NM_200713.1
GAAGGGATGCTCAACAGGGTT
1.4 生物化学分析
前置引物：
超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）以 ZO-1 GAAAGCTCCCGCTCCATAGAA XM_009303250.3
后置引物：
及丙二醛（MDA）的含量使用市购试剂盒（北京索莱 ATCTACATCGGGTTGCCCAG
前置引物：
宝生物科技有限公司）按照制造商的说明进行测 TATCGTTGATTCCCGTCGCC
Claudin-2 后置引物： NM_001004559.2
−
定。SO D 能催化超氧阴离子自由基（ O ）的分解。 TCATCGCAACAGGATGCACT
2
O 能还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜，后者在 560 n m 处 前置引物：
−
2 AACGGCAGTTTCTGTGTAGA
被吸收；SO D 可清除 O ，从而抑制了蓝色甲臜的形 Tjp2 后置引物： NM_001201570.1
−
2 ATCTTGGAGTCCCGCTGTA
成。根据反应溶液在 560 n m 处的吸光度来判断 前置引物：
CCCGTCCATGTGTCAGGAAT
SO 的含量。H O 在 240 n m 下有特征吸收峰， Muc2.1 后置引物： XM_021470771.1
2
D
2
CA 能够分 解 H O ，使反应溶 液 240 n m 下的吸光 TGAGTCCAGTTCCACCATGAC
T
2 2 前置引物：
度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率计算出 Akt2 CACAAAGTCCCGCACCAAAG NM_198146.2
后置引物：
CA 的含量。MD 与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，产 GTGCAACTTCGTCCTTAGCG
T
A
前置引物：
物 在 532 n m 处有一个最大的吸收峰，但其吸收峰因 CACATGCGGGACTTTCAAGC
Tlr-4 NM_001131051.1
后置引物：
可溶性糖而改变。因此，同时测 量 600、53 和 450 TGTTGGCATTGCGTTCCATC
2
A
n m 处的吸收峰，根据差值计 算 MD 的含量。 前置引物：
GCTGGAGCACTAAGGATGGA
1.5 肠道 内 ROS、TNF-α、IL-1 和 LP 水平的测定 Nfkb2 后置引物： NM_001001840.3
β
S
GCACAAAGGGCTCATGCTTC
将斑马鱼肠道组织与适量的生理盐水混合匀 前置引物：
浆，3 000 r/mi 离 心 10 mi 后取上清液，根据活性氧 IL-10 GACCATTCTGCCAACAGCTC NM_001020785.2
n
n
后置引物：
（ROS）、肿瘤坏死因 子 α（TNF-α）、白细胞介 素 1β GACCCCCTTTTCCTTCATCTTT
前置引物：
（IL-1β）和脂多糖（LPS）各自 的 ELIS A 试剂盒（北京 TACTTGCCGGGATCGTTTGA
p53 后置引物： NM_001271820.1
飞默生物科技有限公司）测定其总含量。 在 450 nm CAGGTCCGGTGAATAAGTGC
前置引物：
波长下，用酶标仪（SpectraMax i3x，Molecular Devices， AAATGGAGGTTGGGATGCCT
Bcl2 NM_001030253.2
美国）测定吸光度（OD）。最后绘制各因子的线性回 后置引物：
AAAAGGCTCCGATGGTCACT
归曲线，并根据曲线方程计算各样品的含量。 前置引物：
GCCCGTGAGATCTTCTCTGA
1.6 实时荧光定 量 PC 分析 Bax 后置引物： NM_131562.2
R
CCCTGGTTGAAATAGCCTTGA
使 用 Trizo 裂解试剂（Invitrogen，美国）从肠道
l
前置引物：
组织样本中提取 总 RNA。RN A 的完整性和纯度分 Caspase3 CGTGTGGATACAACAGATGCTA NM_131877.3
后置引物：
别通 过 1 % 琼脂糖凝胶电泳 和 NanoDrop On 平台 CCTGTCCTGCGATCAAAGTT
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