Page 174 - 《环境工程技术学报》2022年第5期

· 1530 · 环境工程技术学报 第 12 卷

1.4 微生物样品分析 以磷酸钙沉淀的形式部分截留下来 [13] ，而反硝化菌
[14]
在磷恢复期的 第 1 天，分别取磷饥饿和磷恢复 群能利用固态的磷酸钙作为磷源 。
6

处理组有机玻璃柱中段单质硫样品，进行微生物群
落结构分析。
1.4.1 DN 提取、PC 扩增 和 lluminaMiSe 测序
A
q
R
TM
使 用 OMEG A 试剂 盒 E.Z.N.A Mag-Bind Soil
DNA Ki 提取样品 总 DN A 后检 测 DN A 质量。利
t
用 Qubit3.0 DN 检测试剂盒对基因 组 DN 精确定
A
A
量后，加入引 物 341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-
3'） 和 805R（5'- GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）
进行聚合酶链反应（PCR），使 用 PC 基因扩增仪来 图 1 常规运行期和磷饥饿期进出水 NO x -N − 浓度及去除率
R
扩增细 菌 16S rRN 基因 的 V3～V 区，扩增条件： Fig.1 Concentrations of influent and effluent NO x -N and its
4
A
−
94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，45 ℃ 20 s，65 ℃ 30 s， 个循 removal efficiency during the normal and phosphorus
5
环；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，2 个循环；最后 starvation periods
0
延 伸 72 ℃ 5 min。PC 产物作为 第 2 轮扩增的模 随着磷饥饿期 NO -N 去除率的下降，出水中出
R
−
x
板，引 入 Illumin 桥 式 PC 兼容引物，扩增条件：95 现了亚硝酸盐的积累， NO -N 浓度由常规运行期的
R
a
−
2
℃ 3 min，94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s， 个循环； 低 于 0.05 mg/L，迅速增加 至 4.08～6.78 mg/L，占出
5
最后延 伸 72 ℃ 5 min。 在 2%（w/v）琼脂糖凝胶上检 水中 NO -N x 浓度 的 40%～64%（ 图 2）。Wan 等 研
]
[9
g
−
测 PC R 产物，并使用 Qubit3. 荧光定量仪进行定 究表明，在磷限制开始的 前 6 内，硝酸盐去除率无
0
d
量。 设 3 个平行样，将纯化的扩增子等摩尔合并， 明显降低，但出水中亚硝酸盐开始积累，表明在磷限
MiSe 文库构建和测序均在生工生物工 程 (上海 股 制条件下，亚硝酸盐的还原成为反硝化的限速步
)
q
份有限公司进行，测序平台 为 llumina MiSeqPE300。 骤。此外，在低硫氮比 [15-16] 、 低 HRT [10,16-17] 、不适宜
1.4.2 序列处理与分析 的 pH [18 ] 等多种情况下，也发现了亚硝酸盐积累的情
获得原始序列后，使 用 PRINSE Q 过滤质量低 况。Zho 等 [19 ] 研究发现，在硫自养反硝化系统中，
u
于 2 的碱基。通 过 USEARC H 将优化后的序列以 硝酸盐的还原速率高于亚硝酸盐，硫自养反硝化细
0
97 % 的相似度聚类 为 OTU，然后将代表性序列与核 菌更偏好利用硝酸盐作为电子受体，在不利的环境
糖体数据库（RD 数据库，http://rdp.cme.msu.edu）进 条件下，这种偏好表现更明显。
P

行比对。使 用 Mothu 软件基 于 OT 信息计 算 Alpha
U
r
多样性指数，包 括 Shannon、Simpson、Cha 和 Ace
o
指数。
2 结果与讨论
2.1 磷饥饿对硫自养反硝化效果的影响
整个试验期间，进水中的 NO -N 主要为 NO -N，
−
−
x 3
其占 NO -N x 的 99 % 以上。磷饥饿期进 水 T 浓度≤ 图 2 常规运行期和磷饥饿期进出水 NO -N − 2 浓度
−
P
0.05 mg/L，该水平的磷浓度会显著降低硫自养反硝 Fig.2 Concentrations of influent and effluent NO -N during the
−
2
[9]
化效率 。由 图 1 可知，在进入磷饥饿期的 第 8 天， normal and phosphorus starvation periods
硫自养反硝化效率显著下降， NO -N x 去除率 由 98.1%～ 2.2 硫自养反硝化所需的最低磷浓度
−
d
99.6 % 降 至 70.3%，随着磷饥饿期的延长， NO -N 去 在经 过 20 的磷饥饿后， 将 7 个处理组进水磷
−
x
除率进一步降 至 24.8%～49.6%。但在进入磷饥饿 浓 度 分 别 调 至 0.050 、0.075 、0.100 、0.200 、0.300、
期的 前 5 内， NO -N 去除率与常规运行期相比无 0.400、0.500 mg/L，以分析硫自养反硝化所需的最低
−
d
x
显著差异，可能 有 2 种原因：1）硫自养反硝化细菌对 磷浓度。由 图 3 可知，进水磷浓度越高的处理组，其
磷饥饿有一定的耐受性；2）硫自养反硝化细菌利用 NO -N 去除率越快恢复至饥饿前水平。进水磷浓度
−
x
前期基质吸附沉淀的磷进行生长代谢。有研究表 为 0.400、0.500 mg/ 的处理组， NO -N去除率在补
−
L
x
明，硫-石灰石自养反硝化系统能有效将进水中的磷 充磷的第 3 天，恢复至磷饥饿前水平，稳定达到